
DEAE磁珠
¥1000.00
BeaverBeads Magrose DEAE是一種弱陰離子交換磁珠,具有快速的磁響應(yīng)性、豐富的離子交換能力和極高的蛋白結(jié)合能力。離子交換配基為二乙氨乙基(diethylaminoethyl, DEAE), 該配基在pH3-12的工作范圍內(nèi)仍然能夠保持穩(wěn)定的高蛋白結(jié)合能力。 與傳統(tǒng)柱層析純化方式相比,Magrose DEAE磁珠無(wú)需對(duì)粗蛋白樣品進(jìn)行預(yù)處理(如:反復(fù)繁瑣的離心,費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)濾操作),此外,無(wú)需控制流速及柱壓,不需要昂貴的層析設(shè)備。對(duì)于熟練的操作者來(lái)說(shuō),在很短時(shí)間內(nèi)就能完成高純度目的蛋白的提取,且能輕松實(shí)現(xiàn)多個(gè)樣品的平行處理,實(shí)現(xiàn)高通量的蛋白純化。
- 產(chǎn)品貨號(hào):70809-5
- 產(chǎn)品單位:瓶
- 產(chǎn)品說(shuō)明:5 mL, 10%(v/v), 30-150 μm
產(chǎn)品名稱(chēng) | BeaverBeadsTM Magrose DEAE |
磁珠粒徑范圍 | 30~150 μm |
離子交換類(lèi)型 | 弱陰離子基團(tuán) |
總離子能力 | 110~170 μmol/mL Gel |
蛋白結(jié)合量1 | ≥110 mg BSA/mL Gel |
保存液 | 20% 乙醇 |
懸液濃度2 | 10% (v/v) 磁珠懸液 |
保存溫度 | 2~30°C (長(zhǎng)期保存,建議置于2~8°C) |
工作pH范圍 | 3-12 |
注:1. 蛋白結(jié)合量與目標(biāo)蛋白特性相關(guān),此處僅作參考值;
2. 1 mL磁珠懸液中含有100 μL磁珠。
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
1、 磁響應(yīng)速度快,減少操作時(shí)間
2、磁珠具有良好的分散性和重懸性,提高操作的便捷性
3、配基具有良好的物理化學(xué)穩(wěn)定性,提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性及可重復(fù)性
磁珠黏壁現(xiàn)象是什么原因?如何解決?
由于疏水性蛋白黏附在磁珠上導(dǎo)致磁珠黏壁。建議緩沖液中加入0.05% tween-20。如果不能改善,不建議繼續(xù)重復(fù)使用。
是否再生后可以用于不同蛋白的純化?
純化不同種類(lèi)的蛋白時(shí),建議使用新的磁珠。
是否可以不再生來(lái)重復(fù)使用呢?
一般使用3次后需要再生,多次重復(fù)使用會(huì)降低純化效率約50%。
IDA-鎳和IDA-鈷的區(qū)別,怎么選擇?
IDA-鎳的蛋白載量高,40mg/mL Gel,純度稍低,90%。
IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mL Gel,純度95%。
一般客戶建議購(gòu)買(mǎi)IDA-鎳磁珠,即可達(dá)到目的。
緩沖液中咪唑添加的意義?
結(jié)合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附;
洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白;
洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。
磁珠再生后,蛋白純化效果變差,如何解決?
①再生過(guò)程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果,參考說(shuō)明書(shū)中磁珠再生部分步驟4。
②重新掛金屬離子后為清洗干凈,需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結(jié)合,影響蛋白與磁珠的結(jié)合。
目標(biāo)蛋白難洗脫
穿透組分中目標(biāo)蛋白明顯減少,而洗脫組分中目標(biāo)蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min,離心跑電泳,如果發(fā)現(xiàn)較多蛋白殘留。
(1)洗脫調(diào)節(jié)太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時(shí),可以嘗試降低洗脫液pH至4.0,但低pH會(huì)也導(dǎo)致金屬離子脫落,磁珠需要再生后再使用。
(2)蛋白吸附在磁珠上無(wú)法洗脫。對(duì)于非特異性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl濃度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100。對(duì)于聚集沉淀在磁珠上的(尤其注意含有二硫鍵的蛋白),可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進(jìn)行變性洗脫。
洗脫產(chǎn)物雜帶多,是什么原因?
(1)雜蛋白吸附。由于組氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白質(zhì)中很常見(jiàn)基團(tuán),而蛋白折疊可能導(dǎo)致幾個(gè)這樣的氨基酸殘基臨近,這樣也會(huì)使它們和磁珠的作用力增加??梢杂貌煌瑵舛鹊倪溥蜻M(jìn)行梯度洗脫,在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附,或使用鈷離子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要獲得純度較高的蛋白,需要對(duì)裂解、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進(jìn)行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白,則需要考慮使用多步純化,結(jié)合使用離子交換、凝聚過(guò)濾等純化方法;
(2)菌體破碎條件太劇烈導(dǎo)致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎;降低超聲破碎的強(qiáng)度,縮短時(shí)間;適當(dāng)稀釋樣品,添加核酸酶,降低樣品粘稠度;
(3)蛋白被部分水解:添加合適的蛋白酶抑制劑,并盡可能在低溫下操作。
是什么原因?qū)е录兓玫降牡鞍琢可伲?
(1)磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%,對(duì)于親和力較高的蛋白,每毫升磁珠懸液可結(jié)合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據(jù)目標(biāo)蛋白含量,使用足夠量的磁珠。對(duì)于親和力較低的蛋白,需要增加磁珠用量,延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,或提高樣品及結(jié)合緩沖液pH;
(2)蛋白與磁珠親和力較低。參考問(wèn)題1;
(3)蛋白濃度低。對(duì)樣品進(jìn)行濃縮,或增加磁珠用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間;
(4)磁珠重復(fù)使用次數(shù)太多。將磁珠進(jìn)行再生處理(參考產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))。
His-tag蛋白不吸附或親和力低是什么原因?
首先確認(rèn)純化前的樣品中是否有目標(biāo)蛋白。
(1)有目標(biāo)蛋白,但大量穿透:
a、蛋白不含有標(biāo)簽或未能正確表達(dá)。
解決措施:Western Blot鑒定目標(biāo)蛋白是否有His-Tag。若沒(méi)有,需要重新構(gòu)建載體,添加組氨酸標(biāo)簽,并確認(rèn)標(biāo)簽正確表達(dá)。
b、蛋白折疊導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽未完全暴露。
解決措施:
在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素,這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對(duì)松散,也許能吸附而蛋白不會(huì)變性。
在變性條件下純化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。
如果蛋白有二硫鍵,最好加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇(在樣品中添加),可以改善蛋白的吸附。
重新構(gòu)建載體,將組氨酸標(biāo)簽換到另外一端,或在組氨酸標(biāo)簽基因與目的基因之間增加一段Linker,可以降低蛋白折疊后標(biāo)簽被掩蓋的幾率。
c、標(biāo)簽太短。
解決措施:將標(biāo)簽的組氨酸數(shù)量增加至6-10個(gè)。
d、蛋白標(biāo)簽被水解。
解決措施:添加合適的蛋白酶抑制劑;盡量在低溫下處理樣品;對(duì)于分泌表達(dá)的蛋白,長(zhǎng)時(shí)間存放將增加蛋白被降解的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)盡快處理樣品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集。
解決措施:在結(jié)合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,減少蛋白聚集。
f、樣品及結(jié)合緩沖液不合適:解決措施:確認(rèn)樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外,將樣品及結(jié)合緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.4~8.5,有利于蛋白結(jié)合。
g、樣品及結(jié)合緩沖液中咪唑濃度太高:解決措施:降低樣品及結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度。
(2)有目標(biāo)蛋白,但含量很低:
蛋白表達(dá)量低。解決措施:對(duì)樣品進(jìn)行濃縮,增加磁珠用量、延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間;優(yōu)化表達(dá)條件(誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間,培養(yǎng)基等);或更換其他合適的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)。

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