
Strep-tag II蛋白純化試劑盒
¥2080.00
專為高效、快速純化Strep-tag II蛋白而設計的一種新型功能化材料。Strep-tag II 僅由8個具有化學平衡的氨基酸 短肽組成( Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) ,使得對重組蛋白的結構和活性的影響可忽略不計,因此在純化 過程中無需對目標蛋白中Strep-tag II進行切除;同時在生理條件下即可對目標蛋白進行純化,與其它tag相比, 這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質的生物活性,并可獲得純度超過99%的目標蛋白。
- 產(chǎn)品貨號:70808-K10
- 產(chǎn)品單位:瓶
- 產(chǎn)品說明:5 mL, 10%(v/v), 30-150 μm
產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱 | BeaverBeads? Magrose Strep-Tactin |
磁珠粒徑 | 30-150 μm |
配基含量 | -6 mg StrepTactin /mL Gel |
蛋白結合量 | -7 mg Strep-tag II蛋白/mL Gel① |
懸液濃度 | 10%(v/v) 磁珠懸液② |
保存液 | 1 x PBS(0.I%Tween-20+0.05%NaN3) |
保存溫度 | 2- 30℃(長期保存,建議置于2- 8℃) |
Binding/Washing Buffer | 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH8.0 |
Elution Buffer | 2.5 mM desthiobiotin in Binding Buffer |
Regeneration Buffer | 0.5 MNaOH or 1 mM HABA |
注:1、蛋白結合量與目標蛋白特性相關,此處僅作參考。
2、1 mL磁珠懸液中含有100 μL磁珠
應用實例
圖1. BeaverBeadsTM Magrose Strep-Tactin 純化Strep- tagII-eGFP蛋白的SDS-PAGE圖譜
通過圖1 顯示:利用BeaverBeads? Magrose Step-Tactin磁珠在生理條件下即可快速、有效地純化出Strep-tag II -eGFP 目標蛋自,重復使用多次情況下,其目標蛋自純度可持續(xù)保持99%以上,高純度的目標蛋自便于進行后續(xù)的功能性研究。
磁珠黏壁現(xiàn)象是什么原因?如何解決?
由于疏水性蛋白黏附在磁珠上導致磁珠黏壁。建議緩沖液中加入0.05% tween-20。如果不能改善,不建議繼續(xù)重復使用。
是否再生后可以用于不同蛋白的純化?
純化不同種類的蛋白時,建議使用新的磁珠。
是否可以不再生來重復使用呢?
一般使用3次后需要再生,多次重復使用會降低純化效率約50%。
IDA-鎳和IDA-鈷的區(qū)別,怎么選擇?
IDA-鎳的蛋白載量高,40mg/mL Gel,純度稍低,90%。
IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mL Gel,純度95%。
一般客戶建議購買IDA-鎳磁珠,即可達到目的。
緩沖液中咪唑添加的意義?
結合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附;
洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白;
洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。
磁珠再生后,蛋白純化效果變差,如何解決?
①再生過程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果,參考說明書中磁珠再生部分步驟4。
②重新掛金屬離子后為清洗干凈,需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結合,影響蛋白與磁珠的結合。
目標蛋白難洗脫
穿透組分中目標蛋白明顯減少,而洗脫組分中目標蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min,離心跑電泳,如果發(fā)現(xiàn)較多蛋白殘留。
(1)洗脫調節(jié)太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時,可以嘗試降低洗脫液pH至4.0,但低pH會也導致金屬離子脫落,磁珠需要再生后再使用。
(2)蛋白吸附在磁珠上無法洗脫。對于非特異性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl濃度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100。對于聚集沉淀在磁珠上的(尤其注意含有二硫鍵的蛋白),可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進行變性洗脫。
洗脫產(chǎn)物雜帶多,是什么原因?
(1)雜蛋白吸附。由于組氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白質中很常見基團,而蛋白折疊可能導致幾個這樣的氨基酸殘基臨近,這樣也會使它們和磁珠的作用力增加。可以用不同濃度的咪唑進行梯度洗脫,在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因為疏水相互作用導致非特異吸附,或使用鈷離子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要獲得純度較高的蛋白,需要對裂解、結合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白,則需要考慮使用多步純化,結合使用離子交換、凝聚過濾等純化方法;
(2)菌體破碎條件太劇烈導致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎;降低超聲破碎的強度,縮短時間;適當稀釋樣品,添加核酸酶,降低樣品粘稠度;
(3)蛋白被部分水解:添加合適的蛋白酶抑制劑,并盡可能在低溫下操作。
是什么原因導致純化得到的蛋白量少?
(1)磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%,對于親和力較高的蛋白,每毫升磁珠懸液可結合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據(jù)目標蛋白含量,使用足夠量的磁珠。對于親和力較低的蛋白,需要增加磁珠用量,延長反應時間,或提高樣品及結合緩沖液pH;
(2)蛋白與磁珠親和力較低。參考問題1;
(3)蛋白濃度低。對樣品進行濃縮,或增加磁珠用量、延長反應時間;
(4)磁珠重復使用次數(shù)太多。將磁珠進行再生處理(參考產(chǎn)品說明書)。
His-tag蛋白不吸附或親和力低是什么原因?
首先確認純化前的樣品中是否有目標蛋白。
(1)有目標蛋白,但大量穿透:
a、蛋白不含有標簽或未能正確表達。
解決措施:Western Blot鑒定目標蛋白是否有His-Tag。若沒有,需要重新構建載體,添加組氨酸標簽,并確認標簽正確表達。
b、蛋白折疊導致組氨酸標簽未完全暴露。
解決措施:
在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素,這樣蛋白結構相對松散,也許能吸附而蛋白不會變性。
在變性條件下純化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。
如果蛋白有二硫鍵,最好加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇(在樣品中添加),可以改善蛋白的吸附。
重新構建載體,將組氨酸標簽換到另外一端,或在組氨酸標簽基因與目的基因之間增加一段Linker,可以降低蛋白折疊后標簽被掩蓋的幾率。
c、標簽太短。
解決措施:將標簽的組氨酸數(shù)量增加至6-10個。
d、蛋白標簽被水解。
解決措施:添加合適的蛋白酶抑制劑;盡量在低溫下處理樣品;對于分泌表達的蛋白,長時間存放將增加蛋白被降解的風險,應盡快處理樣品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集。
解決措施:在結合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,減少蛋白聚集。
f、樣品及結合緩沖液不合適:解決措施:確認樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外,將樣品及結合緩沖液pH調節(jié)至7.4~8.5,有利于蛋白結合。
g、樣品及結合緩沖液中咪唑濃度太高:解決措施:降低樣品及結合緩沖液中的咪唑濃度。
(2)有目標蛋白,但含量很低:
蛋白表達量低。解決措施:對樣品進行濃縮,增加磁珠用量、延長反應時間;優(yōu)化表達條件(誘導劑濃度、誘導溫度、誘導時間,培養(yǎng)基等);或更換其他合適的表達載體或表達系統(tǒng)。

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