
Strep-tag II蛋白純化磁珠
¥1980.00
專為高效、快速純化Strep-tag II蛋白而設(shè)計(jì)的一種新型功能化材料。Strep-tag II 僅由8個(gè)具有化學(xué)平衡的氨基酸 短肽組成( Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) ,使得對重組蛋白的結(jié)構(gòu)和活性的影響可忽略不計(jì),因此在純化 過程中無需對目標(biāo)蛋白中Strep-tag II進(jìn)行切除;同時(shí)在生理?xiàng)l件下即可對目標(biāo)蛋白進(jìn)行純化,與其它tag相比, 這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質(zhì)的生物活性,并可獲得純度超過99%的目標(biāo)蛋白。
- 產(chǎn)品貨號:70808-5
- 產(chǎn)品單位:瓶
- 產(chǎn)品說明:5 mL, 10%(v/v), 30-150 μm
產(chǎn)品特性
產(chǎn)品名稱 | BeaverBeads? Magrose Strep-Tactin |
磁珠粒徑 | 30-150 μm |
配基含量 | -6 mg StrepTactin/mL Gel |
蛋白結(jié)合量 | -7 mg Strep-tag II蛋白/mL Gel① |
懸液濃度 | 10%(v/v) 磁珠懸液② |
保存液 | 1 x PBS(0.I% Tween-20+0.05% NaN3) |
保存溫度 | 2- 30℃(長期保存,建議置于2-8℃) |
Binding/Washing Buffer | 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH8.0 |
Elution Buffer | 2.5 mM desthiobiotin in Binding Buffer |
Regeneration Buffer | 0.5 M NaOH or 1 mM HABA |
注:1、蛋白結(jié)合量與目標(biāo)蛋白特性相關(guān),此處僅作參考。
2、1 mL磁珠懸液中含有100 μL磁珠
應(yīng)用實(shí)例
圖1. BeaverBeadsTM Magrose Strep-Tactin 純化Strep- tagII-eGFP蛋白的SDS-PAGE圖譜
通過圖1 顯示:利用BeaverBeads? Magrose Step-Tactin磁珠在生理?xiàng)l件下即可快速、有效地純化出Strep-tag II -eGFP 目標(biāo)蛋自,重復(fù)使用多次情況下,其目標(biāo)蛋自純度可持續(xù)保持99% 以上,高純度的目標(biāo)蛋自便于進(jìn)行后續(xù)的功能性研究。
磁珠黏壁現(xiàn)象是什么原因?如何解決?
由于疏水性蛋白黏附在磁珠上導(dǎo)致磁珠黏壁。建議緩沖液中加入0.05% tween-20。如果不能改善,不建議繼續(xù)重復(fù)使用。
是否再生后可以用于不同蛋白的純化?
純化不同種類的蛋白時(shí),建議使用新的磁珠。
是否可以不再生來重復(fù)使用呢?
一般使用3次后需要再生,多次重復(fù)使用會降低純化效率約50%。
IDA-鎳和IDA-鈷的區(qū)別,怎么選擇?
IDA-鎳的蛋白載量高,40mg/mL Gel,純度稍低,90%。
IDA-鈷的蛋白載量稍低,25mg/mL Gel,純度95%。
一般客戶建議購買IDA-鎳磁珠,即可達(dá)到目的。
緩沖液中咪唑添加的意義?
結(jié)合緩沖液中低濃度的咪唑是為了減少雜蛋白的非特異性吸附;
洗滌緩沖液中低濃度咪唑是為了吸取吸附能力較弱的雜蛋白;
洗脫液中高濃度咪唑是為了洗脫目的蛋白。
磁珠再生后,蛋白純化效果變差,如何解決?
①再生過程的堿處理可以改善再生磁珠的蛋白純化效果,參考說明書中磁珠再生部分步驟4。
②重新掛金屬離子后為清洗干凈,需要增加洗滌步驟。殘留的金屬離子優(yōu)先跟蛋白結(jié)合,影響蛋白與磁珠的結(jié)合。
目標(biāo)蛋白難洗脫
穿透組分中目標(biāo)蛋白明顯減少,而洗脫組分中目標(biāo)蛋白很少,取少量磁珠加SDS-PAGE Loadding Buffer于95℃加熱5~10min,離心跑電泳,如果發(fā)現(xiàn)較多蛋白殘留。
(1)洗脫調(diào)節(jié)太溫和。提高洗脫液咪唑濃度至700mM還不能洗脫時(shí),可以嘗試降低洗脫液pH至4.0,但低pH會也導(dǎo)致金屬離子脫落,磁珠需要再生后再使用。
(2)蛋白吸附在磁珠上無法洗脫。對于非特異性疏水吸附的蛋白,可以增加NaCl濃度至1M,或添加0.1%~2%的Triton X-100。對于聚集沉淀在磁珠上的(尤其注意含有二硫鍵的蛋白),可以在洗脫緩沖液中加入6M鹽酸胍進(jìn)行變性洗脫。
洗脫產(chǎn)物雜帶多,是什么原因?
(1)雜蛋白吸附。由于組氨酸,色氨酸,半胱氨酸等是蛋白質(zhì)中很常見基團(tuán),而蛋白折疊可能導(dǎo)致幾個(gè)這樣的氨基酸殘基臨近,這樣也會使它們和磁珠的作用力增加。可以用不同濃度的咪唑進(jìn)行梯度洗脫,在樣品及平衡緩沖液中添加0.5%吐溫或Triton X-100,或5~50%的甘油,可以避免因?yàn)槭杷嗷プ饔脤?dǎo)致非特異吸附,或使用鈷離子螯合磁珠(BeaverbeadsTM IDA-Cobalt)。此外,要獲得純度較高的蛋白,需要對裂解、結(jié)合緩沖液、洗滌緩沖液、洗脫緩沖液的組分、pH、咪唑濃度等進(jìn)行優(yōu)化。若還是不能獲得高純度的蛋白,則需要考慮使用多步純化,結(jié)合使用離子交換、凝聚過濾等純化方法;
(2)菌體破碎條件太劇烈導(dǎo)致蛋白斷裂。確保在冰浴條件下破碎;降低超聲破碎的強(qiáng)度,縮短時(shí)間;適當(dāng)稀釋樣品,添加核酸酶,降低樣品粘稠度;
(3)蛋白被部分水解:添加合適的蛋白酶抑制劑,并盡可能在低溫下操作。
是什么原因?qū)е录兓玫降牡鞍琢可伲?
(1)磁珠用量不足。本產(chǎn)品磁珠懸液濃度為10%,對于親和力較高的蛋白,每毫升磁珠懸液可結(jié)合的蛋白量約為3~4mg。用戶需要根據(jù)目標(biāo)蛋白含量,使用足夠量的磁珠。對于親和力較低的蛋白,需要增加磁珠用量,延長反應(yīng)時(shí)間,或提高樣品及結(jié)合緩沖液pH;
(2)蛋白與磁珠親和力較低。參考問題1;
(3)蛋白濃度低。對樣品進(jìn)行濃縮,或增加磁珠用量、延長反應(yīng)時(shí)間;
(4)磁珠重復(fù)使用次數(shù)太多。將磁珠進(jìn)行再生處理(參考產(chǎn)品說明書)。
His-tag蛋白不吸附或親和力低是什么原因?
首先確認(rèn)純化前的樣品中是否有目標(biāo)蛋白。
(1)有目標(biāo)蛋白,但大量穿透:
a、蛋白不含有標(biāo)簽或未能正確表達(dá)。
解決措施:Western Blot鑒定目標(biāo)蛋白是否有His-Tag。若沒有,需要重新構(gòu)建載體,添加組氨酸標(biāo)簽,并確認(rèn)標(biāo)簽正確表達(dá)。
b、蛋白折疊導(dǎo)致組氨酸標(biāo)簽未完全暴露。
解決措施:
在樣品和平衡緩沖緩沖液中加1-2M尿素,這樣蛋白結(jié)構(gòu)相對松散,也許能吸附而蛋白不會變性。
在變性條件下純化蛋白,加入4~8M尿素或4~6M鹽酸胍使蛋白變性。
如果蛋白有二硫鍵,最好加1-2mM DTT或1~5mM巰基乙醇(在樣品中添加),可以改善蛋白的吸附。
重新構(gòu)建載體,將組氨酸標(biāo)簽換到另外一端,或在組氨酸標(biāo)簽基因與目的基因之間增加一段Linker,可以降低蛋白折疊后標(biāo)簽被掩蓋的幾率。
c、標(biāo)簽太短。
解決措施:將標(biāo)簽的組氨酸數(shù)量增加至6-10個(gè)。
d、蛋白標(biāo)簽被水解。
解決措施:添加合適的蛋白酶抑制劑;盡量在低溫下處理樣品;對于分泌表達(dá)的蛋白,長時(shí)間存放將增加蛋白被降解的風(fēng)險(xiǎn),應(yīng)盡快處理樣品。
e、蛋白溶解度偏低或聚集。
解決措施:在結(jié)合緩沖液中添加0.5%-1% Tween-20、Triton X-100,或5%~50%的甘油,可以增加蛋白的溶解度,減少蛋白聚集。
f、樣品及結(jié)合緩沖液不合適:解決措施:確認(rèn)樣品及緩沖液中不含有EDTA、還原劑等。另外,將樣品及結(jié)合緩沖液pH調(diào)節(jié)至7.4~8.5,有利于蛋白結(jié)合。
g、樣品及結(jié)合緩沖液中咪唑濃度太高:解決措施:降低樣品及結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度。
(2)有目標(biāo)蛋白,但含量很低:
蛋白表達(dá)量低。解決措施:對樣品進(jìn)行濃縮,增加磁珠用量、延長反應(yīng)時(shí)間;優(yōu)化表達(dá)條件(誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間,培養(yǎng)基等);或更換其他合適的表達(dá)載體或表達(dá)系統(tǒng)。

暫無視頻

暫無應(yīng)用案例